Главная / Полезные статьи / Генетика дрожжей

Генетика дрожжей

Дрожжевой завод сегодня предлагает очень качественную продукцию.
ß-Глюканазыß-Глюканаза ячменя термолабильна и легко разрушается в процессе солодораще-ния. В результате ß-глюканы ячменя часто обнаруживаются в пиве, создавая трудности при фильтрации и вызывая образование мути, осадков и гелей. Для преодоления этих трудностей к затору или в сусло часто добавляют микробные ß-глюканазы. Соответственно, перенос генов, кодирующих ß-глюканазы, в пивные дрожжи представляет значительный интерес. Гены были клонированы из Bacillus subtilis , из Trichoderma reesei и из ячменя. Первые попытки экспрессии гена В. subtilis в дрожжах были разочаровывающими, принеся только низкие уровни внутриклеточной активности. Экспрессия была заметно увеличена помещением гена ß-глюканазы под контроль дрожжевого промотора A£># 1 [17]. Трансформированные пивные дрожжи внутриклеточно продуцировали высокие уровни ß-глюканазы, но в пиве определялось только очень низкое содержание этого фермента (возможно, как следствие лизиса клеток).

Значительные уровни внеклеточной ß-глюканазы были получены лишь при введении сигнальной последовательности для дрожжевой секреции [106]. В этой последней работе бактериальный ген был помещен под контроль дрожжевого промотора A/Fa и сигнальной последовательности a-фактора спаривания. Селекцию трансформантов проводили на основе устойчивости к хлорамфени-колу. Процесс брожения с использованием трансформированных дрожжей был идентичен брожению с применением родительских пивных дрожжей, однако плотность экспериментального пива и содержание в нем ß-глюкана были значительно меньше, а фильтруемость пива — гораздо лучше.Все упомянутые работы по трансформации пивных дрожжей генами бактериальных глюканаз включали в себя использование мультикопийных плазмид, что сопровождалось неизбежными проблемами нестабильности. Однако оказалось, что у трансформированных дрожжей верхового брожения нестабильность была гораздо выше, чем у дрожжей низового брожения [17]. Это было подтверждено в работе с использовании других плазмид. Если окажется, что в большинстве случаев это действительно так, то данный факт является еще одним свидетельством, подтверждающим фундаментальное различие двух типов дрожжей.

Чтобы гарантировать адекватную экспрессию в трансформированных дрожжах, ген Р-глюканазы из Г. reesei был помещен в дрожжевой модуль экспрессии (кассету) PGK, который, в свою очередь, был вставлен и в мультикопийную, и в интегрирующую плазмиды [34]. Так как грибные внеклеточные ферменты, в отличие от своих бактериальных аналогов, эффективно экскретируются дрожжами, то в этом случае не требовалось введения специфических сигнальных последовательностей для дрожжевой секреции. Селекцию трансформантов проводили на базе устойчивости к меди. р-Глюканы сусла эффективно расщеплялись трансформантами обоих типов, фильтруемость пива была значительно лучше, а процесс брожения и характеристики пива в основном не менялись [34, 145]. Несмотря на то что конструкции на базе мультикопийной плазмиды были менее стабильны, чем интегрированные трансформанты, они продуцировали значительно более высокие уровни р-глюканазной активности.Р-Глюканазы из ячменя, обычно в пивоварении отвечающие за расщепление р-глю-кана, демонстрируют наивысшую активность при pH 4,7 (в отличие от бактериальных ферментов, которые наиболее активны при pH 6,7). Таким образом, они больше годятся для производства пива и введения в пивные штаммы. Чтобы клонировать гены для этого фермента, были соединены две отдельные последовательности ДНК, изолированные из алейронового слоя ячменя и составляющие вместе ген р-глюкана-зы ячменя. Затем этот ген был присоединен к сигнальной последовательности секреции а-амилазы мыши и вставлен в вектор экспрессии между дрожжевым промотором ADH\ и терминальными последовательностями. Далее конструировали интегративный вектор по той же схеме, которая использовалась для экспрессии глюкоамилазы A. niger (рис. 3.5). Используя в качестве селективного маркера устойчивость к G418, был получен ряд дрожжевых трансформантов, и все они продуцировали внеклеточную р-глюканазу [175]. Подобный интегративный трансформант пивных дрожжей был использован для производства пива на опытной установке — содержание р-глюкана в пиве оказалось значительно ниже нормы, вкус и стойкость пены не изменились, а скорость фильтрования заметно увеличилась.

Добавить комментарий